1986年，参演首部《难忘的中学时光》。1988年，主演《疯狂的代价》，获得第十一届大众电影百花奖和第八届中国电影金鸡奖最佳女主角提名。

1990年，参演张丰毅主演的电影《龙年警官》，获得第十三届大众电影百花奖最佳女配角奖。

1991年，参演首部电视剧《雪山飞狐》，一人同时饰袁紫衣和银姑两个角色

1992年，与斯琴高娃共同主演获得四十三届柏林电影节大奖“金熊奖”的影片《香魂女》。

1994年，参演王志文、许晴主演的电视剧《东边日出西边雨》，饰演陈丹妮。

1997年，伍宇娟自编自导影片《山茶花开》，因为用人不当，折腾到最后，剧组只剩下她一个人，还欠下一大笔钱，为了还钱，从不拍电视剧的她开始涉足电视圈。

2002年5月，参演姜文主演的电影《寻枪》，饰演韩小芸。

2003年，参演讲述白衣天使与医院抗击非典的一线医护人员的电视剧《没有硝烟的战场》，出演英雄天使叶欣。

2004年，参演电视剧而在《红莓花儿开》中，伍宇娟扮演了夏太平的妻子花月风，一个脾气暴躁甚至有些神经质的女人。

2005年10月，与刘威主演的电影《爱亦无声》上映，饰演盲女郝梅；主演电视剧《用我的生命去爱你》，在剧中饰演“妈妈”薛芙蓉。

2020年7月，出演脱贫攻坚题材电视剧《江山如此多娇》。